Studio di genetica di popolazione del corallo solitario Leptopsammia pruvoti in Mediterraneo.

IN GENERALE

In generale, il ciclo di riproduzione dei coralli è complesso in quanto può essere di tipo asessuato (es. per scissione ), di tipo sessuato (es.feconazione: incontro di gameti diversi), oppure misto, derivante da entrambi i meccanismi riproduttivi .

Gli Antozoi(vedi sistematica della specie) infatti, sono in parte a sessi separati, in parte ermafroditi. La fecondazione avviene all’esterno o nel corpo stesso del polipo; in questo secondo caso possono esserci “cure parentali”, fino a, quando la larva, provvista di 12 tentacoli, abbandona la madre. Dall’uovo fecondato hanno origine perlopiù planule completamente ciliate, che vivono nel plancton per una settimana circa.La larva derivante dalla riproduzione sessuata si muove mediante ciglia e può avere o una elevata capacità di dispersione (dispersione pelagica, cioè nel mare), o una bassa capacità di dispersione (dispersione bentonica, cioè sul fondo).

Le uova sono espulse direttamente (ovipari) o sviluppate nella madre e liberate sottoforma di larva (vivipari); vi sono anche forme ovovivipare (animale che partorisce prole viva, che si è sviluppata nel corpo della madre ma che si nutre di solo vitello contenuto nell’uovo, poiché manca la placenta).

Dopo essersi fissate al substrato, la larva si metamorfosa nell’animale adulto. Accanto alla riproduzione sessuata è molto diffusa anche quelle asessuata (spesso con formazione di colonie ) che avviene tramite gemmazione, lacerazione del disco pedale o, più raramente tramite scissione trasversale o longitudinale del polipo.

IN PARTICOLARE QUESTO CORALLO...

Tramite studi istologici, svolti presso il nostro laboratorio, è stato descritto per la prima volta il ciclo riproduttivo del Leptopsammia pruvoti.

 Questo corallo si riproduce sessualmente (fecondazione incrociata) ed è caratterizzato da gonocoria (i sessi sono separati) e da ovoviviparità (incubazione, da parte della madre, degli embrioni), (Fadlallah 1983;Harrison 1985,Goffredo et al.2000). Inoltre, le larve generate da questo corallo si muovono con moto cigliare di tipo neutro per dispersione pelagica (Gerrodette 1981;Fadlallah e Pearse 1982; Goffredo e Zaccanti 2004),ed hanno una elevata capacità di dispersione a differenza di quanto normalmente succede nelle forme ovovivipare (Dunn et al 1980; Jackson 1986; Ayre e Hughes 2000; McFadden et al.2001).

 Diverse strategie riproduttive sono comunemente associate a differenti capacità di dispersione larvale nell’ambiente(Hedgecock 1986; Palombi 1992;Ayre et al. 1997).

Lo scopo della mia ricerca è quello di investigare la variabilità genetica delle popolazioni di Leptopsammia pruvoti in diversi siti del Mediterraneo.

La struttura genetica riscontrata sarà usata per analizzare le modalità di riproduzione di questa specie in relazione alla dispersione delle sue larve.

Al fine di comprendere meglio lo studio di genetica di popolazione è opportuno precisare quanto segue.La genetica di popolazione ha ad oggetto lo studio dell’ereditarietà dei caratteri determinati da uno o pochi geni, al fine di valutare, attraverso analisi statistiche, la frequenza con cui quest’ultimi sono presenti in una popolazione, e pertanto, la relativa variabilità genetica.

La costituzione genetica di un individuo è comunemente conosciuta con il termine di GENOTIPO (composizione allelica), mentre la forma in cui il genotipo si manifesta viene detto FENOTIPO.

Per allele si intende, la componente di una coppia di geni omologhi (presenti su cromosomi uguali), responsabili di forme alternative di uno stesso carattere.

Due alleli possono essere uguali (organismo OMOZIGOTE per quel carattere) o diversi (organismo ETEROZIGOTE). Esempio….

I genetisti di popolazione studiano i modelli di variabilità genetica che si trovano all’interno di gruppi di individui (struttura genetica delle popolazioni) ed inoltre la loro evoluzione nel tempo e nello spazio.

La prospettiva di questo studio si fa quindi più ampia nel senso che non considera più il singolo individuo ma è rivolta all’analisi di gruppi fertili tra loro (popolazione mendeliana) che condividono un’insieme di geni comuni (pool genico).

Per prima cosa, per studiare la composizione di una popolazione mendeliana è necessario descrivere quantitativamente il pool genico del gruppo calcolando le frequenze genotipiche ed alleliche all’interno della popolazione.

Nella maggiorparte dei casi i genetisti utilizzano la frequenza degli alleli per descrivere un pool genico. Infatti, negli organismi che si riproducono per via sessuata i genotipi si riducono agli alleli al momento della formazione dei gameti e pertanto sono quest’ultimi a venire trasmessi da una generazione all’altra.

Di conseguenza, solo gli alleli hanno una continuità temporale ed il pool genico si evolve attraverso variazioni nelle frequenze alleliche.

I campioni, per le analisi di laboratorio, sono stati prelevati a seguito d’immersioni con autorespiratore ad aria in cinque siti del Mediterraneo (Calafuria, Sestrunj ,Palinuro,Capraia, Elba) ed in diversi periodi dell’anno. Il campionamento è avvenuto mediante prelievo a circa 16 m di profondità  di un numero variabile di coralli da noi considerati più belli, suddividendoli in 3 patch distanti l’uno dall’altro due cicli di pinneggiata.

Una volta trasportati in dipartimento all’interno di un frigo contenente acqua di mare, vengono osservati al microscopio binoculare, puliti, misurati e privati di eventuali ovociti (cellule uovo femminili). Dopodichè posti in appositi recipienti (eppendorf) vengono conservati in un frigo alla temperatura di -80 gradi.

Le analisi di laboratorio per lo studio delle popolazioni vengono effettuate mediante una tecnica biochimica che separa tra loro proteine con struttura molecolare differente dovuta a mutazioni riguardanti variazioni di cariche amminoacidiche.

Tale tecnica (elettroforesi proteica) è un metodo di separazione basato sulla diversa velocità di migrazione di particelle elettricamente cariche.

La velocità di migrazione dipende: dalla massa, dalla dimensione, dalla carica e dalla forma delle particelle, ossia dalla loro mobilità elettroforetica.

Questa grandezza, essendo una funzione del rapporto tra carica e raggio, è diversa da una particella ad un’altra. Pertanto, applicando un campo elettrico ad una miscela ionica le varie specie migreranno con velocità differente a seconda delle rispettive mobilità elettroforetiche.

I substrati sul quale avviene la migrazione possono essere di vario tipo ma nel mio caso si tratta di  piastre di acetato di cellulosa sorrette da ponti, i quali al momento della corsa elettroforetica vengono posti in apposite vasche conduttrici di corrente grazie alla presenza di una specifica soluzione tampone (con particolari valori di pH) senza del quale la corrente non può passare. Le vasche a loro volta sono collegate ad un alimentatore che genera corrente a determinate condizioni elettriche.

Le piastre di acetato al termine della corsa vengono poste in specifici gel di colorazione che servono per visualizzare le proteine che hanno migrato e che compariranno sottoforma di bande poste a diversa altezza. La lettura di tali bande mi dice sia la composizione allelica dei vari organismi sia se quest’ultimi sono omozigoti o eterozigoti. .

Ogni gel di colorazione è specifico per  l’enzima-proteina che voglio far rilevare e corrisponde ad un determinato locus genico.

La prima fase consiste nell’individuazione di locus genici che presentano più di un allele nell’ambito di una popolazione (locus genico polimorfico). Fin ad ora sono stati testati dodici locus genici ma solo due, per l’esattezza la PGI e la HK, sono stati considerati validi perché ripetibili a determinate condizioni.

Per attenersi alle procedure standard relative a questo tipo di studio, i locus polimorfici da identificare devono essere almeno sei e devono risultare certi cioè ripetibili per uno stesso gruppo di individui all’interno di una popolazione presa come riferimento (Calafuria)

La seconda fase consiste nella analisi delle altre popolazioni per mezzo di marker che rappresentano quei campioni caratterizzati da un allele che trovo con maggiore frequenza in tutti i locus genici di uno stesso gruppo della popolazione di riferimento.

Tale marker mi da un valore che potrò usare come metro di misura per individuare la posizione degli altri alleli appartenenti a campioni sconosciuti delle altre popolazioni.

Attualmente in laboratorio gli esperimenti sono indirizzati nella messa a punto di un  protocollo regolato dagli standard utilizzati sui coralli per questo tipo di studio.

L’elaborazione dei dati verrà eseguita avvalendosi di programmi statistici di genetica di popolazione (GENEPOP, F-stat,…).

 Infine dal calcolo delle frequenze alleliche e dalla rielaborazione statistica dei dati sarà possibile trarre delle ipotesi scientifiche.

In particolare, se gli effetti genetici dei fenomeni di fecondazione incrociata si sommassero a quelli di buona capacità di dispersione, dovrebbe verificarsi:

-all’interno delle popolazioni, un’elevata eterozigosità (cioè molti individui con due alleli differenti) ed un’alta variabilità genetica (una grande numero di alleli diversi).

-tra le popolazioni, un alto flusso genico (grande dispersione allelica) e una scarsa divergenza ( poca differenze di struttura genica e quindi di variabilità genetica).

Sabrina Di Ceglie - Marine Science Group